การผลิตไวรัสในเซลล์แมลงเพื่อใช้ปราบแมลงศัตรูพืช
Production of Baculovirus in Insect Cell Culture for Biopesticide
ทุนอุดหนุนการวิจัย พัฒนาและวิศวกรรม ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ

ดร.เพ็ญจันทร์ เมฆวิจิตรแสง (หัวหน้าโครงการ)
Phenjun Mekvichitsaeng. (Researcher)
ดร.กนกวรรณ พุ่มพุทรา
Kanokwan Poomputsa. (Lecturer)
คุณอุทัย เกตุนุติ
ผศ.ดร.ยุวพิน ด่านดุสิตาพันธ์
Yuwapin Dandusitapunth. (Asst. Prof.)
สถาบันพัฒนาและฝึกอบรมโรงงานต้นแบบ

ความสำคัญและที่มาของการวิจัย

โครงการวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างความสามารถในการเลี้ยงเซลล์แมลง โดยใช้การผลิตแบคคิวโลไวรัสในเซลล์แมลงเป็นต้นแบบสำหรับการผลิตผลิตภัณฑ์จากเซลล์แมลง ไวรัสนี้ใช้เป็นสารชีวภาพเพื่อควบคุมแมลงศัตรูพืชที่เป็นที่นิยมเนื่องจากมีความปลอดภัยสูงต่อสิ่งแวดล้อมและเกษตรกรผู้ใช้รวมทั้งผู้บริโภค โครงการนี้ผลิตแบคคิวโลไวรัสชนิดนิวเคลียร์โพลีฮีโดรซีสไวรัส (Nuclear Polyhedrosis virus, NPV) ซึ่งมีความจำเพาะต่อหนอนเจาะสมอฝ้าย Helicoverpa armigera ในขวดทดลองซึ่งมีขึ้นตอนต่างๆ ได้แก่ การคัดแยกไวรัส การทำไวรัสให้บริสุทธิ์ การเพิ่มปริมาณไวรัส การผลิตผลึกไวรัส และการทำสูตรสำเร็จของผลิตภัณฑ์ (formulation)
การคัดแยกไวรัสจากเลือดหนอนเจาะสมอฝ้ายที่เป็นโรคสายพันธุ์ที่พบในประเทศไทย พบว่าหนอนเจาะสมอฝ้ายที่เหมาะสมในการคัดแยกไวรัสจากเลือดคือหนอนวัยห้าที่เป็นโรคประมาณ 36 ชั่วโมง และเติม cysteine ลงไปในเลือด 150 ppm เพื่อป้องกันการเกิดปฏิกิริยา melanization จากการศึกษาพบว่าเซลล์แมลง Heliothis zea (Hz) มีความจำเพาะกับไวรัสนี้โดยยอมให้ไวรัสเข้าสู่เซลล์ มีการเพิ่มจำนวนและสร้างผลึกโพลีฮีดราในนิวเคลียส หลังจากทำการเก็บไวรัสอิสระ (extracellular virus) ที่ได้จากการใช้เลือดหนอน infect ในเซลล์แล้วนำไวรัสส่วนนี้มาทำการแยกให้บริสุทธิ์ โดยใช้วิธี plaque assay โดยทำการคัดแยกไวรัสจาก 1 plaque เพื่อให้ไวรัสที่จะนำไปใช้งานต่อไปมีแหล่งเริ่มต้นจากไวรัสเช่นกัน ปริมาณไวรัสอิสระที่ผลิตได้สำหรับเป็นสต๊อกไวรัสคือ 109PFU/ml
การศึกษาประสิทธิภาพในการฆ่าหนอนของผลึกไวรัสสายพันธุ์ของประเทศไทย (bioassay) เปรียบเทียบกับผลึกไวรัสสายพันธุ์จากประเทศออสเตรเลียโดยวิธีการ broassay กับหนอนเจาะสมอฝ้ายวัยที่ 2 พบว่าผลึกไวรัสสายพันธุ์ของไทยมีประสิทธิภาพในการทำลายได้ดีกว่า โดยทำการทดลองที่มีความเข้มข้นของผลึก 2.5X105, 5X105, 1X106 และ 2X106 PIBs/ml พบว่าความเข้มข้นของผลึกที่ 5X105 PIBs/ml เป็นความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดที่ใช้ทำการทดลองเพราะสามารถทำลายหนอนได้ดีเมื่อเทียบกับการใช้ผลึกความเข้มข้นสูงกว่า
ประสิทธิภาพในการฆ่าหนอนของผลึกไวรัสจะลดลงตามลำดับ เมื่อหนอนมีอายุมากขึ้น (ขนาดตัวโตขึ้น) จากการทดลองใช้ผลึกไวรัสความเข้มข้น 5X105 PIBs/ml กับหนอนทดลองวัยที่2 3 และ4 พบว่า หนอนวัยที 2 ตาย 95% ขณะที่หนอนวัยที่ 4 ตายเพียง 40%
ประเทศไทยมีการผลิตไวรัส NPV จากตัวหนอนแมลงโดยกรมวิชากการเกษตรในระดับกึ่งอุตสาหกรรมในรูปการทดลองใช้ในแปลงสาธิต ซึ่งใช้ได้ผลดีเป็นที่ยอมรับของเกษตรกรรและกำลังทำการผลิตในเชิงการค้า นอกจากนี้มีบริษัทนำเข้าผลิตภัณฑ์ไวรัส NPV จากสหรัฐอเมริการชื่อการค้าว่า Spod X ใช้ควบคุมหนอนกระทู้หอม (Spodoptera exigua) และไวรัส NPV ที่ผลิตจากตัวหนอน Helicoverpa zeaใช้ควบคุมหนอเจาะสมอฝ้าย (Helicoverpa zea) ชื่อ Gemstar

วัตถุประสงค์ของโครงการ

  1. เพื่อผลิตไวรัส NPV (local strain) ในเซลล์แมลง (cell culture)
  2. เพื่อทดสอบคุณภาพของไวรัสที่ผลิตได้ในการทำลายหนอนเจาะสมอฝ้าย
  3. เพื่อพัฒนาเทคโนโลยีการเลี้ยงเซลล์สัตว์ในถังหมักที่สามารถนำมาประยุกต์ใช้ในการผลิตรีคอมบีแนนต์โปรตีน (recombinant protein) ชนิดอื่น

ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับจากการวิจัย

  1. ได้เทคนโนโลยีการเลี้ยงเซลล์สัตว์เพื่อใช้ในการผลิตสารชีวภาพในระดับห้องปฏิบัติการ
  2. สามารถผลิตไวรัส NPV โดยการเลี้ยงในเซลล์แมลงที่มีคุณภาพในการทำลายหนอนและไม่มีการปนเปื้อน
return research 41. topic

Revised: 8 August 2000